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　　一、核心原理：雙抗體夾心法

　　包被

　　實驗開始前，96孔微孔板的孔內(nèi)壁已經(jīng)預先包被了一種高度特異性的捕獲抗體。這種抗體是針對大鼠胰島素受體β (ISR-β) 分子上的一個特定抗原表位的。

　　這些抗體牢固地吸附在塑料板表面，用于“捕獲"后續(xù)步驟中的目標蛋白。

　　加樣與結(jié)合

　　將您的待測樣本(如大鼠的血清、血漿、細胞裂解液或組織勻漿)加入到微孔中。

　　如果樣本中含有大鼠ISR-β蛋白，它會被孔板上的捕獲抗體特異性地捕捉并固定住。

　　洗滌：洗去所有未被結(jié)合的蛋白質(zhì)和其他雜質(zhì)。

　　加檢測抗體

　　加入另一種檢測抗體。這種抗體同樣針對大鼠ISR-β分子，但識別的是另一個不同的抗原表位。

　　因此，它能與已被捕獲的ISR-β蛋白結(jié)合，形成 “捕獲抗體-抗原-檢測抗體"的“三明治"復合物。

　　再次洗滌：洗去所有未結(jié)合的檢測抗體。

　　加酶標記物

　　加入一種酶標記的二抗(例如，辣根過氧化物酶-HRP標記的鏈霉親和素-Streptavidin，如果檢測抗體是生物素-Biotin標記的)。這個二抗會特異性地與檢測抗體結(jié)合。

　　此時，復合物變?yōu)?“捕獲抗體-抗原-檢測抗體-酶標記二抗" 。

　　第三次洗滌：洗去所有未結(jié)合的酶標記物。此時，孔中留下的酶量就與樣本中ISR-β的量直接相關(guān)。

　　加底物顯色

　　加入酶的無色底物(如TMB)。留在孔中的酶(如HRP)會催化底物發(fā)生化學反應，生成藍色的產(chǎn)物。

　　終止與測定

　　加入終止液(通常是稀硫酸)來終止酶促反應。反應液的顏色會由藍色變?yōu)榉€(wěn)定的黃色。

　　立即使用酶標儀在450 nm波長下測量各孔的光密度值(Optical Density, OD值)。

　　二、定量原理：標準曲線

　　顏色的深淺(OD值的高低)與孔中結(jié)合的酶量成正比，而酶量又與樣本中ISR-β的含量成正比。

　　為了實現(xiàn)精確定量，試劑盒會提供一系列已知濃度的ISR-β標準品。將這些標準品與待測樣本在同一塊板上同時進行操作。

　　以標準品的濃度為橫坐標(X軸)，以其對應的OD值為縱坐標(Y軸)，繪制出一條標準曲線。

　　最后，將待測樣本的OD值代入這條標準曲線，即可計算出樣本中大鼠ISR-β的精確濃度。

　　原理總結(jié)流程圖：

　　包被捕獲抗體 → 加入樣本(ISR-β被捕獲) → 洗滌 → 加入檢測抗體 → 洗滌 → 加入酶標記二抗 → 洗滌 → 加入底物顯色 → 終止反應 → 測定OD值 → 通過標準曲線計算濃度

　　注：以上僅供參考，科研使用，不作為實際數(shù)據(jù)，實驗需嚴格遵循說明或咨詢技術(shù)老師。

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